김선종 교수의 지상강좌

자가치아이식의 현재와 미래 (3)

1. 지연치아이식 및 동종치아이식을 위한 냉동 보관

세포의 활성도를 장기간 유지하는 방법

저온보존법
얼음이 어는 온도 전까지 온도를 낮춰 세포 대사를 감소시켜 보관하는 방법.
심장, 간, 췌장, 신장 등 Organ 의 단기간 보존으로 장기이식수술에 적합하다.

냉동보존법(Cryopreservation)

세포를 장기간 보관할 때 많이 사용.
냉동과 해동 과정에서 얼음 결정과 증가된 용질의 축적으로 인한 삼투압의 증가로 인한 세포 손상이 가능 a 동해방지제의 사용과 다양한 냉동 방법의 개발.
Cryopreservation (액체 질소를 이용한 냉동 보존,)
liquid nitrogen 의 boiling point인→196 °C (195.8)까지 냉동하며 췌장세포, 혈구 세포, 골수 세포, 정자 등 여러 조직 세포의 장기간 보관을 위하여 널리 사용되고 있다. 냉동이 가능한 조직(Freezable tissues )은 Thin samples and small clumps of individual cells, Semen ,Blood ,Special cells for transfusion, Stem cell등이다.

Historical  research

1953년 Luyet과 Gonzales가 닭의 뇌조직을 -196℃에서 저장하여도 생존하는 것을 처음으로 관찰하였고 Christopher Polge는 1957년 Cryopreservation of fowl sperm을 시행하여 영국에서 조직의 냉동보관을 선도하였다. 1980년Houle과 Das등 포유류의 Fetus의 뇌피질 조직이 -96℃에서 1∼18주간 생존이 가능함을 보고  냉동 보관된 조직의 평균 세포 생존율은 약 60% 전후 냉동보관 기간이 세포 회복과 생존율 곡선에 영향을 미치지 않는 것을 보고 하였고, 신경 세포조직은 생존율의 소실 없이 -196℃에서 370일간 냉동보관이 가능하다고 보고되었다.

치아의 냉동보존

자가 치아 지연 이식 및 동종 치아이식을 위해 반드시 극복해야 하는 냉동보관법의 확립, 면역반응, 거부반응, HLA 항체검사등과 냉동 보관된 유치 및 제3대구치를 통한 줄기세포치료가 가능할 수 있다. Schwartz 가 1983,1985,1986년 발표한 논문을 통해 1주간 냉동 보관 후 및 18개월간의 냉동보관의 결과 4년까지 PDL이 정상치유 됨을 보고하였다.
냉동보존의 유용성으로는 교정치료 중 발거 된 치아를 즉시 이동시키기에는 수용부의 공간문제나 결손의 크기 등으로 어려울 때 미래의 결손부위에 교정적 발치나 매복사랑니 발치 된 것을 allograft 하기 위해 , Stem cell의 추출을 위한 목적 등이 있으며 2-stage transplantation technique으로 발표된 수여부와 공여 치근사이의 poor contact 이 Impaired nutrition을 야기하므로 postoperative nutrition 을 증진하기 위해 재생치료 후에 보관 후 재식립 하는 방법을 보고하였다<Fig.6>. 

냉동보존의 어려움으로는 빙정생성시의 손상, 이차적인 용질의 농축으로 인한 삼투압증가로 인한 손상이 가능하므로 동해방지제(Cryoprotectant)로 사용되는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 침투성이 좋아 세포질내의 동해방지효과를 HES(Hydroxyethyl starch) 는 세포질외의 동해방지효과를 위해 응용되고 있다.

Cryoprotectant : 1948년 런던의 Mill Hill에 있는 영국 국립의학연구소에서 glycerol의 동해방지 효과가 보고되었고  1953년에 다시 Dimethyl sulfoxide (DMSO)의 동해방지 효과가 발표되었다. DMSO는 침투성 동해방지제로 많이 사용되며 세포막을 통과해서 세포 내의 DMSO-NaCl-water 용액의  상평형 상태를 변화시키며 냉동점 이하의 온도에서 세포 내 얼음의 형성으로 상대적으로 높아진 염의 농도를 낮추어 세포 손상을 방지, 세포 내 얼음 형성을 막아 세포막 파괴를 방지한다. 동해방지제의 농도가 증가하면 독성이 생기는 문제점이 있다<Fig.7>.

냉동방법

냉동 과정시의 세포에 대한 영향
가장 위험한 2가지 손상은 세포내 얼음 결정의 생성과 용액효과 손상으로 세포막에 기계적인 스트레스와 삼투압 스트레스를 가해 세포막 손상을 야기시켜 세포사(Cell Death)를 일으킬 수 있고 이는 냉동 속도를 일정하게 유지하면(controlled freezing)  최소화할 수 있다. Program freezer (CBS) 를 이용하여 냉동튜브(Cryotube)에 보관된 조직을  -1°C/min의 냉동속도(cooling rate)로 room temperature 에서 freezing point (- 8°C)까지 시행 후 super cooling으로 -196°C까지 냉동하는 방법 등을 비롯하여 최적의 치주인대 세포 및 치아결정조직의 파괴를 최소로 하는 방법의 냉동법이 실험연구 중에 있다<Fig.8>.

활성도 평가방법은 치주인대 세포 (PDL)의 viability and differentiation capability 와 measuring the hardness of dental hard tissue viability
1) MTT assay and a TUNEL assay → a examination of  the viability and apoptotic death of PDL
2) Immunohistochemical staining for alkaline phosphatase capability of PDL cells was maintained by the freezing and thawing procedure<Fig.9>.

 해동(Thawing) 과정시의 세포에 대한 영향

냉동 후  세포 내 크기가 매우 작은 얼음 결정 체가 형성되고 이때 느린 속도로 해동하면 세포 내 작은결정이 응집하여 큰 결정을 형성하는 재결정화 현상이 일어나 세포가 손상을 받게 된다 Gao와 Critser는 급속 해동을 하면 재결정화 현상을 막을 수 있으므로 많은 세포를 살릴 수 있다고 보고하였다.해동방법 (Thawing Methods)으로는 실온 상태에 조직을 10분간 방치하는 느린 해동(Slow thawing)과 37℃의 온수에 2분간 재빨리 담그는 방법인 빠른 해동 (fast thawing)이 있으며 빠른 해동 속도는70∼75℃/min이다.

동종치아이식

부모와 자녀간, 자매간의 동종치아이식은 tissue-located histocompatibility antigens (H-antigens)가 잘 맞는 경우에는 특정면역반응이 지연되거나 감소될 수 있다고 보고되었다20). HLA typing (ABO system, MHC classes I and Il) differentiating HLA regions for A, B, C. DR, DO, and DP loci.)중에서 50 % 이상의 loci (A and B loci) 가 검사결과 동일한 경우에 good match로 시도가 가능하다. 따라서 현재까지의 동종치아이식의 적응증은 Only between close relatives showing highgrade compatibility of their HLA systems 이라고 할 수 있다. 예를 들어 교정치료가 예정된 9-11세의 자녀의 치아를 부모 혹은 나이가 더 많은 형제의 결손부에 이식하는 경우에 가장 좋은 결과가 예상된다. 상담후에 반드시 수년후(5~10년)에는 acute graft rejectionor resorption이 나타날 수도 있슴을 알려주어야 한다. 이식술 4~8주전 HLA typing 이 수여자 및 공여자에서 시행되어야 하며 수여부는 적절한 골의 폭이 있어서 공여치가 잘 유지되고 교합이 가능할 수 있는지를 평가하여야 한다.  <23면에 계속>